Manu habe im Internet unter
www.gyn.de noch was gefunden:
Ejakulataufbereitungsverfahren
Ejakulat Samenprobe, setzt sich zusammen aus der Seminalflüssigkeit und den Spermien. Ist zunächst zäh. Vor Untersuchung und Aufarbeitung muß das Ejakulat ca. 20 Minuten ruhen um sich zu verflüssigen.
Die Samenaufbereitung für die IVF dient der Isolierung ausschließlich beweglicher Spermien aus der Ejakulatsflüssigkeit.
Nur schnell bewegliche Samenzellen sind befruchtungsfähig.
Alle anderen Bestandteile des Ejakulats dürfen nicht mit der Eizelle in Kontakt kommen.
Beschreibung Das Ejakulat wird mit einer speziellen Flüssigkeit (Zellkulturmedium) gemischt, die Mischung wird zentrifugiert. Im Sediment sind jetzt ausschließlich zelluläre Bestandteile des Ejakulats konzentriert. Der Überstand wird verworfen und über das Sediment etwas Zellkulturmedium aufgeschichtet. Bewegliche Spermien schwimmen aktiv aus dem Sediment in die überschichtete Phase des Zellkulturmediums ("swim up"). 10.000 Spermien pro Eizelle werden zur Befruchtung eingesetzt. Durch Zentrifugierung, Waschen im Kulturmedium und Filtrationsprozesse soll eine Konzentration morphologisch normaler und die Selektion motiler Spermatozoen erreicht werden. Es sollte möglichst frei von Seminalplasma, Mikroorganismen, zelluläre Bestandteile und Debris sein.
Konzentration seminalplasmafreier Spermatozoen im Kulturmedium Ejakulat und Kulturmedium werden im Verhältnis 1:3 vermischt. Bei 200 G wird die Suspension für 10 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand abhebt und es zu einer erneuten Suspendierung mit Medium kommt wird die Zentrifugation wiederholt. Das Sediment wird wiederrum mit Medium (1ml) resuspendiert.
Swim-up Die Suspension wird nun für 1-2 Stunden im Brutschrank bei 37° inkubiert. Der Überstand wird verwendet und erneut mit Medium überschichtet. Nach weiterer Inkubation steigen die morphologisch normalen und motilen Spermatozoen in die obere Hälfte des Reagenzröhrchens auf. Den Überstand kann man verwenden, wenn er zentrifugiert und resuspendiert wurde.
Glaswollfiltration Bei diesem Verfahren wird davon ausgegangen, daß morphologisch defekte Speramtozoen an den Glasfasern hängen bleiben. 15 bis 20 mg Glaswollehäufchen werden in den unteren Teil einer Insulinspritze gesteckt. Nun spült man den Filter mit ein paar Millilitern Medium aus. Darauf läßt man das Ejakulat durch den Filter laufen.
Mini-Swim-up Bei 500 G wird das Ejakulat in 5ml Falcon-Röhrechen zwei Minuten zentrifugiert. Anschließend wird es in 0,5mö Medium resuspendiert. Ebenfalls bei 500 G für zwei Minuten erfolt der zweite Zentrifugationschritt, aber im Eppendorf-Röhrchen. Mit geringer Menge an Medium wird nun das Pellet überschichtet. Anschließend landet dies für zwei Stunden im Brutschrank bei 37° für eine weitere Inkubation.
Percoll Hierbei werden die Spermatozoen nach Motilität selektiert. Verschiedene Percollösungen nach abnehmbarer Dichte werden in einem Reagenzglas übereinandergeschichtet und nativ Sperma hinzugefügt. Aufgrund der höheren Dichte von den motilen Spermatozoen lagern sich diese nach der Zentrifugation am Boden an. Nachdem sich der Überstand bis kurz vor das Pellet abgehoben hat, wird das Pellet nun mit Medium überschichtet und resuspendiert. Es folgt nun ein weiterer Zentrifugationsschritt. Der Überstand wird nun abgehoben und das Pellet wird mit einer geringen Menge Medium überzogen
